Wirts- und umweltbezogene Adaptionseigenschaften bei sensiblen und multiresistenten Pseudomonas aeruginosa-Isolaten

Einleitung Pseudomonas (P.) aeruginosa ist einer der bedeutendsten Erreger nosokomialer Infektionen und besiedelt eine Vielzahl an Lebensräumen und Wirtsspezies. Diese Verbreitung ist ohne eine weitgehende phänotypische Adaption nicht denkbar. Isolate Es wurden 318 P. aeruginosa-Isolate untersucht. Darunter 211 multiresistente 4MRGN-Isolate, 38 sensible Human-Isolatesens, 22 Tier-Isolate aus Hundeohren, 45 Wasser- sowie die Referenzisolate PAO1 und PA14. Methoden Die Biofilmbildung wurden jeweils ohne Antibiotika-Zusatz (spontan) sowie mit 1 mg/L, 4 mg/L und 125 mg/L Meropenem (MPM) in einem Biofilm-Assay bestimmt und zusätzlich eine konzentrations-spezifische Stressantwort berechnet. Die in-vitro-Fitness wurde im kompetitiven Wachstumsvergleich getestet und das Verhältnis beider Isolate anhand des Vergleichs von einem Koloniewachstum auf einer Blutagar- und einer Imipenem-haltigen Agarplatte bestimmt. Die Serum-Sensibilität wurde in einem Killing-Versuch mit 5 % humanem Serum bei 30 min Inkubation bestimmt. Die PMN-Sensibilität erfolgte ebenfalls über einen Killing-Versuch bei Exposition des Testisolaten gegenüber einer PMN-Konzentration von 10.000 Zellen/mL für 30 min. Weiterhin wurden die genetisch determinierten Virulenzfaktoren toxA, exoS, exoT, exoU, exoY, cif, nan1, lasA und lasB mittels Polymerase Kettenreaktion bestimmt. Resultate Die 4MRGN-Isolate, die Tier-Isolate und die Wasser-Isolate zeigten alle eine signifikant höhere spontane Biofilmbildung als die Human-Isolatesens. Bei der Stressantwort fanden sich in jeder Gruppe für alle MPM-Konzentrationen Isolate, welche eine Induktion bzw. eine Hemmung der Biofilmbildung zeigten. Eine Hemmung überwog fast immer, wobei diese bei den 4MRGN-Isolaten wesentlich geringer ausfiel. Es wurde eine signifikant höhere in-vitro-Fitness der 4MRGN-Isolate gegenüber allen anderen Gruppen beobachtet. Bei der Serum-Sensibilität zeigten die 4MRGN- und Tier-Isolate signifikant höhere Werte als die Wasser- und Human-Isolatesens. Die Serum-empfindlichen Isolate zeigten eine signifikant höhere spontane Biofilm¬bildung. Bei der PMN-Sensibilität konnte lediglich bei den Human-Isolatensens signifikant niedrigere Werte zu anderen Gruppen festgestellt werden. Die genetisch determinierten Virulenzfaktoren cif, toxA und exoT waren bei fast allen Isolaten vorhanden und lasA und exoY bei den meisten. Die Gene exoS und exoU waren exklusiv, wobei ein höherer exoU-Anteil bei 4MRGN und Wasser-Isolaten beobachtet wurde. Das Gen nan1 war öfter bei den Wasser- und Human-Isolatensens vorhanden. Das Gen lasB war bei den klinischen Human-Isolaten der 4MRGN-Gruppe und Human-Isolatensens seltener vorhanden, als bei den Tier- und Wasser-Isolaten. Diskussion Die beobachteten Biofilmbildungseigenschaften weisen darauf hin, dass mit einem höheren Adaptionsgrad die Biofilmbildung steigt. Die extrem hohe Biofilmbildung der 2 endemischen Stämmen unter den 4MRGN-Isolaten unterstreicht die Verbindung von Biofilmbildung und Persistenz. Die vielfältigen Ausprägungen der Stressantwort zeigen, dass diese induzierbare Biofilmbildung vermutlich in vivo eine wesentlich größere Bedeutung besitzt, als in der Literatur abgebildet. Die wesentlich höhere in-vitro-Fitness der 4MRGN-Isolate ist bemerkenswert. Diese ist vermutlich eine intrinsische Eigenschaft der Isolate, welche ein 4MRGN-Profil trotz Konkurrenzdruck entwickeln. Die Gruppen mit einer hohe Serum-Sensibilität scheinen diesen Nachteil durch eine hohe Biofilmbildung auszugleichen. Die Unterschiede bei den phänotypischen Eigenschaften sowie bei nan1 und lasB deuten auf eine Alteration der Virulenzeigenschaften und des Infektionsweges bei den 4MRGN-Isolaten hin. Dabei scheint es im Gegensatz zu den klinischen Human-Isolatensens zu einer Verschiebung des Infektionsweges hin zu einer passiven Verschleppung von Biofilmen zu kommen. Die Ähnlichkeit der Tier-Isolate zu den 4MRGN-Isolaten ist möglicherweise Folge einer fortgeschrittenen Adaption an den Säuge¬tierwirt, hierdurch kann ein zoonotisches Potential durch eine Amplifikation im Hundeohr nicht ausgeschlossen werden. Introduction Pseudomonas (P.) aeruginosa is one of the most important causes of nosocomial infections and inhabiting a large number of environmental and host species. This distribution is not possible without extensive phenotypic adaptation. Isolates A total of 318 P. aeruginosa isolates were examined. These included 211 multi-resistant 4MRGN isolates, including 2 endemic strains, 38 sensitive human isolates, 22 animal isolates from dog ears, 45 water isolates from samples of the community water supply and the references PAO1 and PA14. Methods Biofilm formation was determined in a biofilm assay for spontaneous biofilm formation without addition of antibiotics and stress induced biofilm formation with 1 mg/L, 4 mg/L and 125 mg/L meropenem (MPM) respectively. A stress-response specific to the used concentration of MPM was also calculated. The in-vitro-fitness was determined in a competitive growth assay. The serum-sensitivity and PMN-sensitivity were determined in a killing assay with 30 min exposition to 5 % human serum or a PMN concentration of 10,000 cells/mL respectively. Furthermore, the genetically determined virulence factors toxA, exoS, exoT, exoU, exoY, cif, nan1, lasA and lasB were determined by PCR. Results The 4MRGN isolates, the animal isolates and the water isolates all showed significantly higher spontaneous biofilm formation than the sensitive human isolates. In each group, isolates showing an induction as well as an inhibition of biofilm formation as stress-response for all MPM concentrations, were observed. Inhibition almost always predominated, although on a lower scale for the 4MRGN isolates. A significantly higher in-vitro-fitness of the 4MRGN group in comparison to all other groups was observed. 4MRGN and animal isolates showed significantly higher serum-sensitivity than the water isolates and sensitive human isolates. Isolates with high serum-sensitivity showed also a significantly higher spontaneous biofilm formation. In the case of PMN-sensitivity, only the sensible human isolates showed significantly lower values than other groups. The genetically determined virulence factors cif, toxA and exoT were present in almost all isolates and lasA and exoY in most isolates. The genes exoS and exoU were exclusive, with a higher proportion of exoU observed in 4MRGN and water isolates. The nan1 gene was more frequently present in the water and sensible human isolates. The gene lasB was present less frequently in the 4MRGN group and sensible human isolate than in the animal and water isolates. Discussion The observed patterns of biofilm formation indicate, that an increase of biofilm formation is associated with a higher degree of adaptation. The ability to form extremely high amounts of biofilm by the two endemic strains underscores the link between biofilm formation and persistence. The variability in stress response shows that inducible biofilm formation is probably of greater importance in vivo than shown in literature. The significantly higher in-vitro-fitness of the 4MRGN isolates is remarkable. This is probably an intrinsic property of the isolates, which developed a 4MRGN profile despite competitive pressure. Groups with high serum-sensitivity seem to compensate this disadvantage with the ability to form higher amounts of biofilm. The differences in the phenotypic properties as well as in nan1 and lasB indicate an alteration in the virulence properties and the route of infection for the 4MRGN isolates. In contrast to the sensible clinical human isolates, there seems to be a shift in the route of infection towards a passive spread of biofilms. The similarity of the animal isolates to the 4MRGN isolates is possibly the result of advanced adaptation to the mammalian host. Through this similarity a zoonotic potential through amplification in the dog’s ear cannot be ruled out.