Untersuchung des eukaryotischen Transkriptionsfaktors TFIIF im Präinitiationskomplex

Die Transkriptionsinitiation stellt einen wichtigen Schritt in der Genexpression dar und erfordert die koordinierte Bewegung von einer großen Anzahl an Proteinen. Insbesondere die strukturelle Erforschung der RNA-Polymerase II (Pol II)-Transkriptionsmaschinerie, bestehend aus Pol II und den generellen Transkriptionsfaktoren liefert wichtige Erkenntnisse für das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen. Wenngleich Strukturanalysen mittels Röntgenstrukturanalyse und Kryo-EM wichtige Erkenntnisse erbracht haben, ist das gewonnene Strukturwissen auf Momentaufnahmen beschränkt. Eine Möglichkeit Dynamiken zu untersuchen, bieten smFRET-Messungen. Mit Hilfe von smFRET können strukturelle Informationen und dynamische Übergänge in makromolekularen Strukturen in Echtzeit aufgedeckt werden. In dieser Arbeit wird mittels smFRET die Struktur und Funktion des Transkriptionsfaktors TFIIF in einem offenen Promotor-Komplex (Open Complex, OC) untersucht. Zuerst wird der Einfluss von TFIIF-Mutanten auf die Position der stromabwärts gelegenen DNA im OC untersucht, um DNA-stabilisierende TFIIF-Domänen zu identifizieren. Hierfür wurden TFIIF-Mutanten kloniert, die Komponenten des OC aus Hefe oder Bakterien isoliert und mit fluoreszierender DNA zu einem OC assembliert. FCS sowie EMSAs wurden eingesetzt, um die vollständige Assemblierung des OCs zu überprüfen. Mit smFRET-Experimenten am TIRF-Mikroskop wurden schließlich TFIIF-Domänen identifiziert, welche die Stabilisierung der stromabwärtigen DNA in der zentralen Spalte beeinflussen. Der zweite Teil der Arbeit beschreibt die Etablierung einer ortsspezifischen Fluoreszenzmarkierung von TFIIF. Erste smFRET-Messungen mit fluoreszent markierter DNA und fluoreszentem TFIIF im OC demonstrierten die Eignung der modifizierten TFIIF-Konstrukte. Dies legte den Grundstein für weitere Experimente zur Lokalisation von dynamischen TFIIF-Domänen, welche mit anderen strukturbiologischen Methoden im OC bisher noch nicht nachgewiesen werden konnten.