Evaluation des Nucleic acid containing unit counts (NACU) als prognostischer Faktor bei systemisch schwer kranken Hunden

Bei schwer kranken Patienten zeigten sich immer wieder vermehrte Events im Bereich des NACU-Counts. Die Vermutung besteht, dass der NACU-Count zu einem großen Teil aus NETs besteht. Bei NETs handelt es sich um filamentöse Strukturen, die aus Nukleinsäuren und Histonen bestehen. Sie sind Teil der angeborenen, unspezifischen Immunantwort und werden bei verschiedenen Stimuli überwiegend von PMNGs freigesetzt (Brinkmann et al., 2004). Es wird vermutet, dass sie eine Rolle bei der Verhinderung der systemischen Ausbreitung spielen (Urban et al., 2009; McDonald et al., 2012; Yipp et al., 2012). In den letzten Jahren konnte auch bei verschiedenen Erkrankungen ein Zusammenhang mit NETs (oder alleinig cfDNS) gestellt werden. Mehrere Studien konnten im allgemeinem zeigen, dass sowohl NETs im speziellen als auch cfDNS ein prognostischer Faktor zu sein scheinen (Forsbloom et al., 2014; Saukkonen et al., 2007). Aber auch in Bezug auf spezielle Erkrankungen zeigte sich zum Beispiel, dass die Hemmung der Produktion von NETs im Sepsismodell die Prognose verbesserte (Colón et al., 2019), bei Pankreatitiden NETs mit der Schwere der Erkrankung korrelieren (Merz et al., 2015), und eine Hemmung der NETose die Prognose bei Pankreatitiden verbessert (Murthy et al., 2019). Auch bei Patienten mit einer septischen DIC konnte ein erhöhter Gehalt an NETs nachgewiesen werden (Delabranche et al., 2017; Stiel et al., 2019). Basierend auf diesen Berichten aus der Literatur und der Arbeit von Kleinert (2019) war es Ziel dieser Arbeit eine allgemeine Betrachtung aus klinischer Perspektive dieses neuen Parameters vorzunehmen. Als erster Schritt wurden retrospektiv Patienten akquiriert, die aufgrund eines Gesundheitschecks in der Klinik für Kleintiere vorstellig wurden. Im zweiten Schritt wurde retrospektiv eine gemischte Patientengruppe gesammelt, die in der Klinik für Kleintiere vorstellig wurden. Aufgrund der Berichte der Literatur, und gestärkt durch erste vorläufige Auswertungen, wurden diese zwei Teile um einen dritten prospektiven Teil in dem spezifische Erkrankungen genauer untersucht wurden erweitert. Es wurden gezielt Patienten mit einer Sepsis, Pankreatitis, IMHA und DIC gesammelt. Zur Bestimmung eines Referenzintervalls wurden 120 gesunde Hunde gesammelt. Es zeigte sich ein Ausreißer, sodass für die statische Auswertung 119 Hunde zur Verfügung standen. Der Median der Gruppe liegt bei 17,1, das gebildete obere Referenzintervall liegt bei 37,9 (90% Konfidenzintervall, 33-53,0). Kein Wert lag unter 1, weshalb auf die Bestimmung eines unteren Referenzintervalls verzichtet wurde. Es konnte keine Altersabhängigkeit festgestellt werden. Zur Bestimmung des Variationskoeffizienten wurden ein gesunder und ein kranker Hund zehnmalig gemessen. Es zeigten sich folgende Ergebnisse für gesund: 38,5 Mittelwert, Standardabweichung 7,14 und Variationskoeffizient 18,6% und bei krank: Mittelwert 300,3, Standardabweichung 16,16 und Variationskoeffizient 8,6%. Die 18% Variationskoeffizient wurden auf die obere Grenze der Konfidenzintervalls addiert, sodass sich ein Graubereich ergibt (38-63 NACUs). Der zweite Teil der Studie besteht aus 201 Patienten, die überwiegend als krank einzustufen sind. Drei Patienten mussten aufgrund visueller Interferenzen im Scattergramm ausgeschlossen werden. Die Ergebnisse hinsichtlich ihrer Diagnosegruppen waren wie folgend: gesund n=6, Median 14; entzündlich infektiös n=29, Median 22; entzündlich nicht infektiös n=27, Median 21, nicht entzündlich n=59, Median 16; Neoplasien n=20, Median 26,5; Gewebeschaden n=37, Median 17; diverse Erkrankungen n= 23, Median 18. Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen, einzig die Mediane der Gruppen Neoplasie, infektiös und nicht infektiös, aber entzündlich setzten sich visuell von den anderen Gruppen ab. Bei 171 Patienten war bekannt, ob sie eine Vorbehandlung mit immunmodulatorischen Medikamenten bekamen, 118 Patienten erhielten Medikamente, 73 erhielten keine Medikamente. Es zeigte sich ein schwach signifikanter Zusammenhang zur Vorbehandlung mit Medikamenten. Es lagen 171 Temperaturmessungen vor, 137 Patienten wiesen eine Normothermie auf, 26 eine Hyperthermie und 8 Patienten eine Hypothermie. Es zeigte sich kein Zusammenhang zwischen NACU-Count und Temperatur. Die teils bestehenden signifikanten Zusammenhänge zwischen Markern einer Entzündungsreaktion und den Retikulozyten in Hinblick auf den NACU-Count sind aufgrund der sehr niedrigen Korrelationskoeffizienten nur eingeschränkt zu betrachten. Im Bezug zur Prognose zeigte sich ein signifikanter Zusammenhang zwischen NACU und dem Überlebensstatus des Patienten. Bei 172 Patienten war ihre drei Monatsprognose bekannt, davon verstarben 37, 135 Patienten überlebten den benannten Zeitraum. Es zeigt sich zwar, dass je höher der NACU-Count, desto eher versterben die Patienten, es ließ sich jedoch kein Cut-off Wert erkennen, ab dem alle Patienten verstarben. Die dritte Gruppe besteht aus insgesamt 74 Hunde, wobei zwei aufgrund visueller Interferenzen ausgeschlossen wurden. Aufgrund des häufigen Vorkommens von mehr als einer der untersuchten Erkrankungen mussten etliche Patienten in die Gruppe „Mehrere“ klassifiziert werden, was zu einem Zusammenschrumpfen der Gruppen führte. Die Ergebnisse hinsichtlich des NACU-Counts waren wie folgende: IMHA: n= 6, Median 42; DIC: n=29, Median 31; Sepsis n=3; Pankreatitis n=12, Median 36,5; Mehrere n=21, Median 36. Es zeigen sich keine statistischen Unterschiede. Ebenfalls zeigt sich kein signifikanter Zusammenhang zwischen der Prognose und dem NACU-Count bei Patienten mit einer DIC, oder der Schwere (gemessen an der Hospitalisierungsdauer) einer Pankreatitis und dem NACU-Count. Die erste, breitgefächerte Betrachtung des klinischen Nutzens des NACU-Counts liefert gemischte Ergebnisse. So zeigen sich einzelne Antworten auf die gestellten Fragen, welchen jedoch mehr neue Fragen folgen. Es konnte gezeigte werden, dass diese Parameter bei einigen Patienten einen klinischen Nutzen haben kann. Gerade da der NACU-Count bei jeglichen Messungen des Hämatologischen Profils am ADVIA® 2120i automatisch erfasst wird, ist die Erfassung großer Patientenmengen einfach zu erreichen. Was zum aktuellen Zeitpunkt sicher anzuraten ist, ist eine visuelle Prüfung (Auswertung der Scattergramme) der erhobenen NACU-Werte, insbesondere bei sehr hohen Werten. Eine weitere Betrachtung des NACU-Counts in fokussierteren Studien erscheint notwendig, aufgrund der immer neuen Erkenntnisse im Bereich der Pathophysiologie und klinischen Diagnostik von zellfreier DNS und NETose ebenfalls vielversprechend. In severely ill patients, there were consistently increased events in the NACU count. It is suspected that the NACU count largely consists of NETs. NETs are filamentous structures composed of nucleic acids and histones. They are part of the innate, nonspecific immune response and are predominantly released by PMNs in response to various stimuli (Brinkmann et al., 2004). They are believed to play a role in preventing systemic spread (Yipp et al., 2012; McDonald et al., 2012; Urban et al., 2009). In recent years, a correlation between NETs (or solely cfDNA) and various diseases has been established. Several studies have generally shown that both NETs specifically and cfDNA appear to be prognostic factors (Forsbloom et al., 2014; Saukkonen et al., 2007). For example, in relation to specific diseases, it was found that the inhibition of NET production improved prognosis in a sepsis model (Colon et al., 2019), that NETs correlate with the severity of pancreatitis (Merz et al., 2015), and that inhibition of NETosis improved prognosis in pancreatitis (Murthy et al., 2019). Elevated NET levels were also detected in patients with septic DIC (Delabranche et al., 2017; Stiel et al., 2019). Based on these reports from the literature and the work of Kleinert (2019), the aim of this study was to provide a general clinical perspective on this new parameter. In the first step, patients who visited the Small Animal Clinic for a health check were retrospectively recruited. In the second step, a mixed patient group who visited the Small Animal Clinic was retrospectively collected. Based on the literature reports and supported by initial preliminary evaluations, these two parts were extended by a third prospective part, where specific diseases were examined more closely. Patients with sepsis, pancreatitis, IMHA, and DIC were specifically collected. To determine a reference interval, 120 healthy dogs were collected. One outlier was identified, leaving 119 dogs for statistical evaluation. The median of the group was 17.1, with the upper reference interval at 37.9 (90% confidence interval, 33-53.0). No value was below 1, so a lower reference interval was not determined. No age dependence was found. To determine the coefficient of variation, a healthy and a sick dog were measured ten times each. The results were as follows for healthy: mean 38.5, standard deviation 7.14, and coefficient of variation 18.6%, and for sick: mean 300.3, standard deviation 16.16, and coefficient of variation 8.6%. The 18% coefficient of variation was added to the upper limit of the confidence interval, resulting in a gray area (38-63 NACUs). The second part of the study consists of 201 patients, predominantly classified as sick. Three patients had to be excluded due to visual interference in the scattergram. The results regarding their diagnostic groups were as follows: healthy n=6, median 14; inflammatory infectious n=29, median 22; inflammatory non-infectious n=27, median 21; non-inflammatory n=59, median 16; neoplasms n=20, median 26.5; tissue damage n=37, median 17; various diseases n=23, median 18. No significant differences were found between the groups, although the medians of the neoplasia, infectious, and non-infectious, but inflammatory groups were subjectively different from the other groups. Of the 171 patients, it was known whether they received pretreatment with immunomodulatory drugs; 118 patients received medication, and 73 did not. A weakly significant association with pretreatment with drugs was found. There were 171 temperature measurements; 137 patients had normothermia, 26 had hyperthermia, and 8 had hypothermia. No correlation was found between the NACU count and temperature. The partially significant correlations between markers of inflammatory response and reticulocytes regarding the NACU count are limited due to very low correlation coefficients. Concerning prognosis, a significant relationship was observed between NACU and the patient’s survival status. Of 172 patients with a three-month prognosis known, 37 died, and 135 survived the specified period. Although higher NACU counts were associated with a higher likelihood of death, no cut-off value could be identified where all patients died. The third group consists of 74 dogs, with two excluded due to visual interference. Due to the frequent occurrence of more than one of the studied diseases, several patients had to be classified into the "Multiple" group, leading to a reduction in the groups. The results regarding NACU count were as follows: IMHA: n=6, median 42; DIC: n=29, median 31; sepsis n=3; pancreatitis n=12, median 36.5; Multiple n=21, median 36. No statistical differences were observed. No significant relationship was found between prognosis and NACU count in patients with DIC or the severity (measured by hospitalization duration) of pancreatitis and NACU count. The first broad consideration of the clinical utility of the NACU count provides mixed results. While some answers to the questions posed are evident, many new questions arise. It has been shown that this parameter can have clinical utility in some patients. Since the NACU count is automatically recorded in any hematological profile measurements on the ADVIA® 2120i, capturing large patient populations is relatively easy. What is currently advisable is a visual review (evaluation of scattergrams) of the collected NACU values, especially with very high values. Further focused studies on the NACU count are necessary and promising, given the ongoing discoveries in the field of pathophysiology and clinical diagnostics of cell-free DNA and NETosis.