Die Erysiphe necator Resistenzen Ren3 und Ren9 aus ’Regent’

The work presented here confirms the two recently described resistance loci Ren3 and Ren9, which confer resistance to grapevine powdery mildew in two independent crosspopulations. The interval of Ren3 could be delimited to a 200 kb region by parallel work. Further it could be shown that this locus enables the plant to react with a HR upon powdery mildew infection. It was possible to reproduce the two described resistance loci by QTL analysis with phenotypic field data in the two populations ’Regent’ x ’Cabernet Sauvignon’ and GF.GA-47-42 x ’Villard Blanc’. Also it was shown that a classification into resistant and susceptible genotypes according to observed SSR marker alleles of the resistance-linked genetic markers was possible. By genotypic and microscopic analysis of specifically selected F1 individuals with recombination on chromosome 15 from different crosses, the genomic interval of the resistance locus Ren9 was reduced to around 300 kb. The genetic markers GF15-08, GF15-10 and Indel-7 where identified to be closely linked to the locus conferring resistance to powdery mildew. Furthermore, HR associated with appressoria after infection with powdery mildew could be confirmed for Ren9. Parallel works on Ren3 enabled an analysis of genes encoded in this resistance locus. Hereby a cluster of four CC-NBS-LRR genes was identified. Transcript analysis of Ren3-1 revealed two different splice variants for this gene. Differential gene expression experiments after inoculation with powdery mildew showed that the two genes Ren3-1 and Ren3-4 are exclusively transcribed in the grapevine cultivar ‘Regent’ and that transcript levels of Ren3-4 are elevated upon infection with powdery mildew. The elevated transcript levels of Ren3-4 could give a hint that this gene might confer the resistance to powdery mildew associated with the resistance locus Ren3. A comparison of Ren3 from ‘Regent’ and the reference genome PN40024 12Xv0 revealed major differences. Here an approximately 110 kb insertion in the coding region of Ren3-4 was identified comprising several retroelements. Also in the promoter region of Ren3-1 an additional retroelement was identified in PN40024 12Xv0. These two insertions probably inactivate the resistance genes in the susceptible PN40024. Their absence explains the exclusive transcription of these two genes in ‘Regent’. PN40024 has a pure V. vinifera background. This grapevine species evolved without the presence of powdery mildew. The insertion of the found retroelements could therefore be a way to silence not needed resistance genes. This silencing mechanism is thought to help prevent autoimmunity conferred by resistance genes. Analysis of differential gene expression upon inoculation with powdery mildew revealed major differences between the resistant cultivar ‘Regent’ and the susceptible cultivar ‘Chardonnay’. Especially by looking at genes of the pathogenesis-related group it could be shown that the resistance response in ‘Regent’ is faster and longer lasting. Additionally, it was possible to analyze possible orthologous genes involved in HR regulation, which were already described in A.thaliana. The differential experession of these genes in ‘Regent’ compared to ‘Chardonnay’ after inoculation with powdery mildew, could indicate the first steps in characterizing the observed HR on a molecular level. Furthermore, it was possible to prepare for the functional analysis of Ren3-1 by generating amiRNA constructs and transforming them into ‘Regent’ for a knockdown of the gene. In addition, it was possible to transform susceptible genotypes with the gene Ren3-1. Durch die hier vorgestellten Arbeiten konnten in zwei unabhängigen experimentellen Kreuzungspopulationen die beiden beschrieben Resistenzloci Ren3 und Ren9 gegen den Echten Mehltau der Weinrebe bestätigt werden. Der Resistenzlokus Ren3 konnte in Parallelarbeiten auf ein 200 kb Intervall eingegrenzt werden und es konnte eine HR als Resistenz-Mechanismus gezeigt werden. In den beiden Kreuzungspopulationen ’Regent’ x ’Cabernet Sauvignon’ und GF.GA-47-42 x ’Villard Blanc’ konnten die beiden Resistenzen durch QTL-Analysen mithilfe von Feldboniturdaten nachgewiesen werden. Der zuvor neu beschriebene Resistenzlokus Ren9 konnte durch genetische und mikroskopische Analysen mit F1-Individuen aus unterschiedlichen experimentellen Kreuzungspopulationen auf ein Intervall von rund 300 kb eingegrenzt werden. Dabei wurden die genetischen Marker GF15-08, GF15-10 und Indel-7 als Resistenz-gekoppelte genetische Bereiche identifiziert. Ebenfalls zeigten diese Analysen eine HR ausgelöst durch die in Ren9 kodierten Gene, nach Inokulation mit dem Echten Mehltau. Durch Parallelarbeit zur Eingrenzung des Resistenzlokus Ren3, war eine Analyse der dort kodierten Gene möglich. Diese Untersuchungen identifizierten ein Cluster aus vier CC-NBS-LRR Genen in diesem Resistenzlokus. Durch Transkript-Analysen konnten zwei unterschiedliche Splice-Varianten des Gens Ren3-1 identifiziert werden. Analysen zur differentiellen Genregulation zeigten, dass die beiden identifizierten R-Gene Ren3-1 und Ren3-4 nur in ’Regent’ transkribiert werden. Für Ren3-4 konnte hierbei eine Induktion nach Inokulation mit dem Echten Mehltau festgestellt werden. Diese Induktion könnte darauf hindeuten, dass Ren3-4 das Resistenz-vermittelnde Gen aus Ren3 ist. Eine vergleichende Analyse des Resistenzlokus Ren3 aus ’Regent’ mit der Sequenz des Referenzgenoms PN40024 12Xv0 zeigte eine etwa 110 kb große Insertion im kodierenden Bereich von Ren3-4. In dieser Insertion wurden mehrere Retrotransposons identifiziert. Im Promotorbereich von Ren3-1 konnte in PN40024 12Xv0 ein zusätzliches Retrotransposon identifiziert werden. Die 110 kb Insertion und das zusätzliche Retrotransposon führen wahrscheinlich dazu, dass die beiden Gene exklusiv in ’Regent’ transkribiert werden. Da PN40024 einen reinen V. vinifera Hintergrund aufweist und diese Art der Weinrebe sich getrennt vom Echten Mehltau entwickelt hat, könnte die Insertion der Retrotransposons ein Hinweis für die Stilllegung von nicht benötigten Resistenzgenen sein. Dies ist ein wirkungsvoller Mechanismus, welcher möglichen Autoimmunreaktionen vorbeugen kann. Bei der Analyse der differentiellen Regulation von bekannten Resistenz-vermittelnden Genen konnten nach Inokulation von ’Regent’ im Vergleich zu der anfälligen Rebsorte ’Chardonnay’ deutliche Unterschiede festgestellt werden. Insbesondere bei der Regulation der bekannten PR-Gene konnte gezeigt werden, dass die Resistenz-Antwort in ’Regent’ schneller und andauernder ist. Bei der differentiellen Genregulations-Analyse konnten des weiteren, mögliche orthologe Gene der HR-Regulation, welche aus A. thaliana bekannt waren, in der Weinrebe untersucht werden. Eine beobachte differentielle Regulation dieser Gene in ’Regent’ verglichen mit ’Chardonnay’ nach Inokulation mit dem Echten Mehltau, stellt den ersten Schritt dar, um auf molekularer Ebene die mikroskopisch beobachtete HR nachzuvollziehen. Es konnten ebenfalls Vorarbeiten für die funktionelle Analyse von Ren3-1 eingeleitet werden durch die Erstellung von amiRNAs zum Knock-down in ’Regent’ und Transformationen von anfälligen Reben mit Ren3-1.